PEI MAX 配制方法与 HEK293F/CHO 瞬时转染方案

在悬浮细胞瞬时转染、重组蛋白、抗体表达、AAV 与慢病毒规模化包装中，Polysciences PEI MAX（货号 24765-1，MW40K 线性 PEI 盐酸盐） 是目前主流的高性价比转染载体。相比经典 PEI 25K，PEI MAX 水解更完·全、水溶性更好、同等 N/P 下细胞毒性更低，适合高密度悬浮体系长时间培养。本文整理标准化母液配制流程、HEK293F/CHO 悬浮瞬转方案、AAV / 慢病毒包装参数，同时标注实操踩坑要点，可直接用于实验室 SOP 搭建。

一、PEI MAX（24765-1）产品基础参数

• 产品名称：PEI MAX，Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride

• 货号：24765-1

• 分子量：40 kDa（线性聚乙烯亚胺盐酸盐）

• CAS：49553-93-7

• 特点：完·全去乙酰化，质子化氮含量高，DNA 复合能力强；常温溶解，不易析出沉淀；适合悬浮 HEK293F、Expi293F、CHO-S、CHO-K1 悬浮株，同时适配贴壁细胞、AAV 三质粒、慢病毒四质粒包装体系

• 形态：白色粉末，盐酸盐形式，无需酸化助溶（和 PEI25K 最大区别）

二、PEI MAX 1 mg/mL 母液标准配制方案（重点）

目标终浓度：1 mg/mL，无内毒超纯水配制，pH 稳定 7.0 左右

材料清单

PEI MAX 粉末（24765-1）、无内毒 Milli-Q 超纯水、1 M NaOH、磁力搅拌器、搅拌子、0.22 μm PES 无菌滤器、无菌离心管 / 冻存管

操作步骤

按目标体积称量粉末，以配 100 mL 为例：称取 100 mg PEI MAX 粉末，加入 90 mL 无内毒超纯水，放入搅拌子，室温磁力搅拌。

• PEI MAX 水溶性优秀，一般 20 min～2 h 可完·全澄清透明，不需要加热，不要高温助溶，高温会加速降解、降低转染活性

待粉末完·全溶解、溶液澄清后，用 1 M NaOH 缓慢滴加，边搅拌边监测 pH，调节至 pH 6.9～7.1（目标 7.0）。

• ❗不要调过碱，pH＞7.5 会影响质子海绵效应，转染效率明显下滑；pH 过低会增加细胞毒性

补加无内毒超纯水定容至 100 mL，混匀。

在生物安全柜内，使用 0.22 μm PES 滤膜过滤除菌（优先 PES，不推荐 NC 膜）。

分装为 0.5 mL / 1 mL 小管，-20℃避光冻存，避免反复冻融；短期使用可 4℃保存，建议 4℃存放不超过 1 个月，长期稳定保存推荐分装冻存。

配制常见坑

• 不要用普通 PBS、培养基直接配制母液，盐分高容易造成 PEI-DNA 复合物团聚；

• 溶解出现轻微絮状物：优先检查 pH；PEI MAX 正常情况下常温纯水溶解是清亮溶液；

• 器具必须无内毒，内毒素会直接导致细胞大量死亡、病毒滴度暴跌。

三、HEK293F 悬浮细胞瞬时转染通用 Protocol（蛋白 / 抗体表达）

前置细胞培养条件

• 培养基：HEK293F 无血清悬浮专用培养基；摇瓶转速 110–130 rpm，37℃、5% CO₂；转染当日细胞状态标准：活率＞95%，细胞密度 2.0–2.5 ×10⁶ cells/mL（悬浮瞬转黄金密度），细胞处于对数生长期，不要高密度积压、不要结块。

• 参考体系：50 mL 摇瓶体系，可按比例放大到 200 mL、1 L、5 L 生物反应器

• 质粒准备：高纯度无内毒质粒（OD260/280=1.8–1.9），总 DNA 用量：1 μg DNA /mL 培养体积；分泌蛋白 / 单抗双质粒（重链：轻链质量比 1:1 或 2:1，根据文献预实验确定）。

• 转染复合物稀释（用无血清培养基稀释，不含添加剂） A 管（DNA 管）：总质粒 DNA + 无血清培养基，稀释至总体积为培养体积的 5%；轻柔混匀。 B 管（PEI MAX 管）：PEI MAX 母液（1 mg/mL）+ 同等体积无血清培养基稀释； PEI MAX : DNA 质量比推荐 2:1（基准），梯度优化区间 1.5:1 ~ 3:1；

举例：50 mL 体系，总 DNA 50 μg，PEI MAX 投加 100 μg，即 100 μL PEI MAX 母液

混合顺序：将 PEI 稀释液缓慢滴加到 DNA 稀释液中，边滴边轻柔颠倒混匀，禁止剧烈涡旋

室温静置孵育 10–15 min，形成 PEI/DNA 复合物（不要超过 20 min，复合物团聚后转染失效）

将复合物混合液缓慢加入摇瓶细胞悬液中，摇匀放回摇床培养

培养与补料：转染后 4–6 h 可按需补料；收获窗口：96 h（4 天）或 120 h（5 天），分泌蛋白一般在第 4–5 天收集上清检测表达量。

四、HEK293F 悬浮 AAV 三质粒包装方案（PEI MAX）

三质粒：pAAV 表达质粒 + pRep/Cap + pHelper，质量比常用 1:1:1（也有方案采用 2:1:1，建议梯度验证）PMC

转染细胞密度：2.0 ×10⁶ cells/mL，活率≥95%

DNA 投量：1.5–2 μg 总 DNA /mL 培养液

PEI MAX : DNA 质量比基准 2:1，优化区间 1.8:1 ~ 2.5:1，不建议超过 3:1（毒性陡增，细胞提前脱落，滴度下降）

复合物孵育：室温 10–15 min

培养条件：37℃，120 rpm；转染后 72 h 或者 96 h 收获细胞 + 上清；AAV 多数方案转染后 72 h 收集细胞裂解纯化，部分方案上清单独收集

可选增效：转染后 16–24 h 添加丁酸钠（NaBu），终浓度 2–5 mM，可提升 AAV 包装滴度，但会轻微降低活率，需要配套工艺优化PubMed

五、HEK293F 慢病毒（LV）四质粒包装方案

1. 四质粒体系：转移质粒、Gag/Pol、VSV-G、Rev，按文献配比混合

2. 细胞密度：1.5–2.0 ×10⁶ cells/mL

3. 总 DNA：1–1.5 μg/mL

4. PEI MAX:DNA 基准 2:1，部分文献用 2.5:1

5. 收获：转染后 48 h、72 h 分别收集上清，过滤浓缩；慢病毒对毒性更敏感，PEI 比例不要过高，优先保活率

六、CHO-S/CHO 悬浮细胞瞬时转染方案（重组蛋白）

CHO 细胞相比 HEK293F 更娇贵，PEI 毒性耐受更低，参数要保守设置

1. 转染密度：1.5–2.0 ×10⁶ cells/mL，活率＞95%

2. DNA 用量：0.8–1 μg/mL

3. PEI MAX:DNA 基准比例 1.5:1，优化区间 1.2:1~2:1，不建议直接用 HEK293F 的 2:1 高比例

4. 收获时间：72–96 h；CHO 瞬转表达周期普遍比 293 短，过长培养容易凋亡、降解目标蛋白

七、梯度优化思路（拿到新细胞株 / 新项目必做）

PEI MAX 电荷密度高于 PEI25K，严禁直接照搬 PEI25K 的 N/P 和质量比，容易过转染、细胞大片死亡。 推荐梯度矩阵： PEI MAX:DNA 质量比：1.5:1、2:1、2.5:1、3:1 检测指标：转染后 24 h 荧光阳性率（GFP 报告质粒）、48/72 h 细胞活率、目标蛋白表达量 / 病毒滴度。

八、关键对比与 FAQ

Q1：PEI MAX 母液 4℃放久了还能用吗？

A：分装 - 20℃冻存稳定性更好；4℃放置超过 1 个月，建议先用 GFP 预实验验证转染活性，不建议直接上病毒包装。

Q2：复合物孵久了浑浊还能不能加细胞？

A：浑浊代表颗粒团聚，转染效率大幅下降，直接废弃，重新配制复合物。

Q3：PEI MAX 和 PEI25K 能不能直接替换比例？

A：不能。同等质量比下 PEI MAX 阳离子负荷更高，同比例毒性更大，必须重新摸梯度，这也是很多实验室换 PEI 后滴度翻车的主要原因。

Q4：贴壁 HEK293T AAV 包装能不能用这套 PEI MAX 母液？

A：母液通用；贴壁体系 DNA 和 PEI 总量按培养面积换算，复合物稀释用 Opti-MEM，其余 pH、配制标准一致。

九、SOP 核心小结

PEI MAX（24765-1）配制核心：无内毒纯水、室温溶解、pH 稳定 7.0、0.22 μm 过滤、分装冻存；

• HEK293F 蛋白表达 / AAV 包装：PEI MAX:DNA 优先 2:1；

• 慢病毒、CHO 悬浮瞬转：保守 1.5~2:1，严控细胞活率；

• 优势场景：悬浮高密度瞬转、追求高滴度病毒、长时间维持细胞活力的规模化生产。