微血管内皮细胞（MicrovascularEndothelialCells,MVECs）是构成微血管（如毛细血管、小静脉）内壁的关键细胞，其培养基及培养方法需严格模拟体内微环境，以维持其特异性功能和形态。以下是微血管内皮细胞培养基的配方、培养方法及关键注意事项的详细说明：
一、培养基核心成分
微血管内皮细胞培养基需包含以下关键成分，以支持细胞增殖、维持屏障功能及抑制平滑肌细胞污染：
基础培养基
推荐选择：
EndothelialCellBasalMedium-2(EBM-2)：专为内皮细胞设计，含低水平生长因子，避免过度刺激。
M199或DMEM/F12：需额外补充生长因子和营养成分。
pH与渗透压：维持pH7.2-7.4，渗透压280-320mOsm/kg。
生长因子与补充剂
内皮细胞生长补充剂（ECGS）：含酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、肝素等，促进内皮细胞增殖。
血管内皮生长因子（VEGF）：浓度5-10ng/mL，维持血管生成潜能。
胰岛素样生长因子-1（IGF-1）：浓度10-20ng/mL，促进细胞贴壁与存活。
氢化可的松：浓度1μg/mL，抑制平滑肌细胞污染。
L-谷氨酰胺：浓度2mM，提供能量代谢底物。
血清与抗生素
胎牛血清（FBS）：浓度5%-10%，提供生长因子和贴壁因子。需筛选低内毒素批次（<0.1EU/mL）。
青霉素-链霉素：浓度100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素，预防细菌污染。
两性霉素B：浓度0.25μg/mL，抑制真菌污染（可选）。
特殊添加剂（按需选择）
Rho激酶抑制剂（Y-27632）：浓度10μM，促进细胞贴壁（适用于原代培养或传代初期）。
肝素：浓度100μg/mL，增强VEGF活性并抑制凝血酶诱导的细胞收缩。
抗坏血酸：浓度50μg/mL，促进胶原蛋白合成，维持细胞外基质稳定性。
二、培养方法详解
1.细胞获取与原代培养
组织来源：
动物模型：大鼠脑、视网膜、肺或脂肪组织；小鼠脑或耳部皮肤。
人类来源：脐带静脉（需消化去除大血管内皮细胞）、脂肪组织或皮肤活检样本。
分离方法：
酶消化法：
剪碎组织至1mm³碎片，用0.1%胶原酶A或II型胶原酶37℃消化30-60分钟。
加入等体积含10%FBS的DMEM终止消化，1000rpm离心5分钟弃上清。
用培养基重悬细胞，通过200目滤网过滤去除未消化组织。
磁珠分选法：利用CD31或VE-cadherin抗体标记内皮细胞，通过磁珠分离纯化。
2.细胞接种与传代
接种密度：
原代细胞：5×10⁴cells/cm²（避免密度过低导致细胞老化）。
传代细胞：3×10⁴cells/cm²（维持对数生长期）。
传代操作：
弃旧培养基，用PBS清洗2次。
加入0.05%胰蛋白酶-EDTA，37℃消化2-5分钟（显微镜下观察细胞变圆）。
加入等体积含血清培养基终止消化，轻柔吹打成单细胞悬液。
1000rpm离心5分钟，用新鲜培养基重悬后接种。
3.培养条件优化
温度与CO₂：37℃、5%CO₂恒温培养箱。
湿度控制：培养瓶内加入3-5mL无菌PBS防止蒸发。
换液频率：
原代培养：每48小时半量换液（避免频繁扰动影响贴壁）。
传代细胞：每24-48小时全量换液（根据培养基颜色变化调整）。
细胞形态监测：
正常内皮细胞呈鹅卵石样排列，形成单层紧密连接。
若出现纺锤形细胞（平滑肌细胞污染）或细胞脱落，需调整血清浓度或添加氢化可的松。
三、关键注意事项
污染防控：
严格无菌操作，使用预封口培养瓶或盖玻片。
定期检测支原体污染（PCR法或荧光染色法）。
细胞鉴定：
免疫荧光检测内皮细胞标志物（如CD31、VE-cadherin、vWF）。
透射电镜观察Weibel-Palade小体（内皮细胞特有细胞器）。
功能验证：
跨内皮电阻（TEER）检测屏障功能（正常值>150Ω·cm²）。
乙酰化低密度脂蛋白（Ac-LDL）摄取实验验证内吞功能。
储存与复苏：
液氮冻存：含10%DMSO的冻存液，-80℃过夜后转入液氮。
快速复苏：37℃水浴1分钟内融化，逐步稀释DMSO至0.1%。
四、应用场景拓展
疾病模型构建：通过高糖培养基模拟糖尿病微血管病变，或缺氧培养模拟缺血性损伤。
药物筛选：检测化合物对内皮细胞增殖、迁移或血管生成的影响（如抗血管生成药物筛选）。
组织工程：与胶原蛋白支架共培养，构建血管化组织模型。
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